??? 摘? 要: 將核酸提取工藝與自動控制相結合,研發(fā)了HS9600全自動核酸提取儀。該儀器以機械臂運動控制為核心,結合移液器定量控制與試劑技術,實現(xiàn)了核酸的分離與純化。文中詳細介紹了機械臂位置控制系統(tǒng)、移液器控制系統(tǒng)、溫控系統(tǒng)等關鍵模塊的設計方法,并描述了系統(tǒng)軟件的功能和設計思想。檢測證明該儀器運動控制穩(wěn)定,可靠性好,提取效果優(yōu),自動化程度高。?
??? 關鍵詞: 核酸提取;機械臂;移液器;溫度控制
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??? 基因重組、DNA序列分析、基因診斷與治療、基因擴增和對目標DNA的定量分析是科學研究與臨床診斷的基本方法,而這些檢測方法都需要從人體的血液、精液或者其他分泌物中提取核酸才能進行。因此,核酸提取效率與純度的高低,直接影響后期研究工作的開展以及實驗結果的準確性。?
??? 目前國內(nèi)多采用半自動,甚至手工方法提取核酸。手工方法耗時、繁瑣、核酸提取效率低,并且容易導致假陰性與交叉感染[1,2]。鑒于這種情況,課題組從多年的手工操作中吸取經(jīng)驗,結合試劑技術,自行研制了具有自主知識產(chǎn)權的HS9600全自動核酸提取儀,利用機械臂完成核酸的提取動作,實現(xiàn)無交叉感染、無菌的操作過程。該儀器大大減輕了操作人員的勞動強度、減少了人工操作過程中的失誤和感染,增強了生物制備過程的安全性、有效性,加快了核酸提取的自動化進程,為分子生物學的研究提供了一種現(xiàn)代化的工具。?
1 基本原理?
??? 核酸是細胞的一種主要成分,支配著蛋白質的合成,主宰著人體的生長、發(fā)育、繁殖、遺傳及變異等一切重大的生命活動,與人體的新陳代謝、免疫功能調(diào)節(jié)、健康長壽有著極其密切的關系,而且起著重要的、決定性的作用。核酸在細胞中總是與各種蛋白質結合在一起,因此,核酸提取是生命科學研究的首要前提。?
??? 核酸提取(核酸的分離與純化)主要是指將核酸與蛋白質、多糖、脂肪等生物大分子物質分開,但在分離核酸時,應保證核酸分子一級結構的完整性,并排除其他分子污染。核酸提取方法一般包括細胞裂解、酶處理、核酸與其他生物大分子物質分離、核酸純化等幾個主要步驟,而每一步驟又可由多種不同的方法單獨或聯(lián)合實現(xiàn)[3]。?
??? 首先通過物理、化學或酶解作用裂解細胞,使核酸釋放出來,并去除與核酸結合的蛋白質以及多糖、脂肪類等生物大分子的過程。在此基礎上,沉淀核酸、去除鹽類和有機試劑等雜質,從而得到純化的核酸。該過程通常采用離心澄清的方法,操作時費時費力。近年來,出現(xiàn)了磁珠分離技術,利用磁珠在一定條件下對核酸具有很強親和力的特點,吸附核酸。當條件改變時,磁珠又可以與其吸附的核酸分離,從而得到純化的核酸。這種方法簡便、高效、易于操作,是目前核酸提取的主要方法[4]。?
??? 為提高效率,降低核酸提取過程的失誤與污染,打破磁珠試劑在核酸提取技術上形成的技術和市場壟斷,課題組經(jīng)過幾年研制,自主開發(fā)出適用于核酸純化的高性能吸附劑,為國內(nèi)自動化提取純化核酸開辟了新的技術發(fā)展路線;在此基礎上,研發(fā)了HS9600全自動核酸提取儀,替代了傳統(tǒng)的手工操作,實現(xiàn)批量化提純。其提取工藝如圖1所示。?
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??? 由圖1可知,HS9600全自動核酸提取儀是基于膜分離法而設計的,在細胞膜裂解的基礎上,通過吸附試劑,使核酸成為大分子(結合核酸),實現(xiàn)核酸分子與其他生物分子分離;再用洗脫液,使核酸脫離,變?yōu)樾》肿?并通過濾膜得到純化的核酸。其過程如下:?
??? (1)裂解:在樣品中加入裂解液,打碎細胞膜;?
??? (2)吸附:在樣品裂解液中加入吸附劑,充分混合,利用核酸的特異性,使其吸附到吸附劑上,蛋白質等分子則不被吸附,再利用濾膜,使核酸分子與其他生物分子分離;?
??? (3)洗滌:將吸附的核酸反復洗滌,去除雜質;?
??? (4)洗脫:將吸附的核酸烘干,然后轉至洗脫緩沖液中,核酸就從吸附劑上被洗脫下來,變成小分子形式,通過濾膜,得到純化的核酸。?
2 系統(tǒng)設計?
??? HS9600全自動核酸提取儀由機械與電控兩部分組成。其中,機械部分由機架、縱向驅動部件、橫向驅動部件、升降機械臂、烘干器及工作臺等零部件構成。其結構布局按照核酸提取的基本流程分為5個工位。工作臺上分別放置裂解液、吸附劑、洗滌液、洗脫液、一次性槍頭、樣品以及空試管等。而電控部分由控制器、步進電機驅動器、步進電機、溫度傳感器和加熱器等部件組成。當提取儀工作時,控制系統(tǒng)驅動機械臂橫向和縱向移動,自動進行裝卸槍頭、定量取液、吹打、排液、加溫等工序而完成所選定的工藝流程。其結構框圖如圖2所示。?
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??? 由圖2可知,整個控制系統(tǒng)采用上下位機結構模式,下位機始終處于監(jiān)聽狀態(tài),其所有任務受上位機指派并完成機械臂的三維運動、自動裝卸槍頭、定量吸液、吹打溶液、控溫等,實現(xiàn)全自動無人操作的核酸提取過程。?
2.1 機械臂位置控制系統(tǒng)?
????核酸提取儀的主要任務是把裂解液、吸附劑、洗滌液分別與血樣混合在一起,并充分吹打、排空,通過加熱到某一特定溫度,再通過添加洗脫液提取核酸的過程。整個操作要求機械臂定位準確。一是因為機械臂上的移液器在向血樣添加不同液體時,要多次插進同一血樣試管里;二是在取液中,有一道工序是取槍頭,即要把槍頭自動裝到移液器上,此時,在機械臂的升降運動中,要求位置誤差不能超過0.1mm。因此,系統(tǒng)采用了滾珠絲桿精確定位。?
????整個機械臂的三維運動由步進電機控制,其驅動器采用SH-2034M,通過上位機計算得到位移的脈沖數(shù),向單片機發(fā)出相應的位移指令,單片機通過I/O定時發(fā)出高低電平信號控制步進電機的轉動和停止。?
????步進電機的軟件設計分啟動升速、途中勻速、到位降速三步進行,采用如圖3所示的梯度曲線逼近加減速曲線,并利用單片機定時器中斷方式控制步進電機的速度。這個功能靠不斷改變定時器裝載值的大小實現(xiàn)。?
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2.2 移液器控制系統(tǒng)?
??? HS9600提取儀的研制是圍繞高精確度多通道移液器這個關鍵部件開展的。向血樣中添加試劑準確與否直接關系到核酸的純化程度高低,在對電子移液器進行充分的市場調(diào)研之后,本提取儀選定由芬蘭BIOHIT公司生產(chǎn)的ePET系列電子移液器(12通道,移液范圍50μl～1200μl)。但該電子移液器并沒有標準的計算機接口,需要對其進行二次開發(fā),以便于全自動提取儀定量移液。?
??? 移液器的工作原理是微電機帶動活塞運動,通過吸筒吸取定量的液體,吸液的多少由光電檢測電路判斷。整個電路由微電機驅動電路與脈沖檢測電路構成,其微電機驅動電路如圖4所示。?
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??? 驅動元件選用場效應管IRF3205[5],其中1、4配對構成正向控制電路;3、2配對構成反向控制電路。此外,為使系統(tǒng)調(diào)試、維護方便,用2個發(fā)光管指示微電機的工作方式:紅燈表示電機正向轉動;藍燈表示電機反向轉動;若2個燈都不亮,表示電機不工作。?
??? (1)D1=1,場效應管全部截止,電機不工作;?
??? (2)D1=0,D2=0,場效應管1、4導通,3、2截止,電機正轉(吸液);?
??? (3)D1=0,D2=1,場效應管3、2導通,1、4截止,電機反轉(吹液)。?
??? 工作中,設定好吸液量之后,啟動微電機工作,其運行速度快慢由PWM占空比實現(xiàn)。PWM的占空比越大,電機轉動的速度越快。?
??? 移液器旋轉的脈沖檢測電路如圖5所示。在微電機的軸上裝有一個輪盤,輪盤上開有均勻間隔的豁槽;發(fā)光管通過豁槽,將光投射到前后放置的T1、T2兩個光敏三極管上;兩個光敏三極管的集電極1、2上產(chǎn)生兩路正交的脈沖信號 ,這兩路正交的脈沖經(jīng)過信號處理電路后,從信號處理電路的3和4輸出。?
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??? 若微電機正轉,即移液器吸液,則在信號處理電路的3端得到一系列脈沖,其脈沖頻率與1、2脈沖頻率相同,而4端始終是低電平信號。?
??? 若微電機反轉,即移液器吹液,則在信號處理電路4端得到一系列脈沖,其脈沖頻率與1、2脈沖頻率相同,而3端始終是低電平信號。?
??? 單片機用兩個計數(shù)器分別計數(shù)3和4上的脈沖,就可以感知電機轉動的方向和角度大小,從而間接檢測吸液筒的活塞運動距離,最終控制吸液、吹液量的多少,以實現(xiàn)提取儀自動操作。?
2.3 溫控系統(tǒng)?
??? 為了提高核酸提取純度,在充分洗滌的基礎上,需要將吸附劑結合的核酸烤干,而溫度的高低與溫度的波動對核酸的提取影響也比較大。因此,需要一個恒定的溫度進行烘烤,才能取得滿意的核酸提取結果。?
??? 在核酸提取儀中,溫控系統(tǒng)包括溫度控制與溫度測量兩部分,溫度控制類似于電阻爐爐溫調(diào)節(jié),調(diào)節(jié)器采用積分分離、增量式PID調(diào)節(jié)器,可以有效抑制過沖現(xiàn)象。其控制器參數(shù)采用實驗方法,由試湊法確定。另外在控溫過程中,根據(jù)當前溫度與設定溫度偏離的遠近,采用不同的比例系數(shù),抑制控溫過程的超調(diào)與純滯后環(huán)節(jié)。其計算公式如下:?
??? Δu(k)=kP(k)[e(k)-e(k-1)]+kLkIe(k)?
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式中,e為偏差;Δu為控制增量;kP為比例系數(shù); kI為積分系數(shù);ε為偏差的門限值;k0為常數(shù);β為可變比例系統(tǒng)的增益,它與偏差成反比關系。?
??? 為避免模擬電路技術設計中面臨的一系列問題(如引線誤差補償和信號調(diào)理電路的誤差等),溫度測量部分采用美國Dallas半導體公司推出的數(shù)字溫度傳感器DS18B20[6],它具有獨特的單總線接口,僅需要占用一個通用I/O端口即可完成與微處理器的通信;其測量溫度范圍為-55℃～+125℃,具有可編程的9位～12位A/D轉換精度,測溫分辨率可達0.0625℃,大大簡化了電路設計,并能滿足系統(tǒng)性能要求。?
2.4 系統(tǒng)軟件?
??? 全自動核酸提取儀的軟件由上位機軟件和下位機軟件兩部分組成。?
??? 在單片機上運行的軟件稱為下位機軟件,采用匯編語言開發(fā)。下位機軟件采用模塊化設計方法,主要包括(1)通信模塊,與上位機通信,接收上位機的命令,并作出應答;(2)控溫模塊,根據(jù)上位機設定的溫度進行控溫;(3)機械臂移動模塊,根據(jù)上位機的命令進行機械臂的移動;(4)移液器控制模塊,根據(jù)上位機的命令進行吸液、吹液和脫槍頭等。?
??? 在PC機上運行的軟件稱為上位機軟件,采用VB.NET語言開發(fā)。上位機軟件主要有三個功能:(1)與下位機通信,命令下位機執(zhí)行控溫、機械臂移動、吸液、吹液和脫槍頭等動作;(2)系統(tǒng)各種數(shù)據(jù)的管理和處理;(3)提供方便的人機對話界面,使用戶可通過鍵盤、鼠標和顯示屏,實現(xiàn)核酸提取工藝的編輯、儀器運行狀態(tài)的顯示和核酸提取過程的控制。其軟件結構見圖6。?
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?? 上位機軟件主要由五大模塊構成:(1)參數(shù)設置模塊,完成各個提取動作的參數(shù)編制,主要是烘干區(qū)溫度、各個溶液(包括:裂解液、洗滌液、洗脫液)的每次移液量與添加量,機械臂升降的位置,吹打的位置等參數(shù)設置。(2)提取工藝組合模塊,本系統(tǒng)配有幾個常用標準動作:裂解、吹打、洗滌、烘干、洗脫、延時等,可根據(jù)實際需要將標準動作進行組合,簡化了規(guī)程的設計。(3)提取模塊,主要功能是通過控制機械臂的運動,帶動核酸在不同緩沖液之間的轉移。這些功能的實現(xiàn)都是靠上下位機之間的數(shù)據(jù)交互,依據(jù)編輯的提取規(guī)程,進行核酸的分離與純化。(4)系統(tǒng)維護模塊,該模塊方便了計量工作的鑒定和維護工程師對儀器的各個部件進行測試,如:移液量的標定、溫度恒溫測定、機械臂位置自檢等。?
3 儀器性能?
??? HS9600全自動核酸提取儀(1臺)經(jīng)檢測,其安全指標和性能指標均符合行業(yè)標準。其中移液精度與溫控精度的實測曲線如圖7和圖8所示。?
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??? 圖7為分別設定移液量為100μl、200μl、300μl的條件下,提取儀自動吸取蒸餾水所得到的曲線。由圖可知,在100μl時,移液器的最大絕對誤差為1.4μl;在200μl時,最大絕對誤差為3.9μl;在300μl時,最大絕對誤差為3.4μl。滿足預期設計的要求。?
??? 圖8為分別設定目標溫度為50℃、70℃、90℃時,提取儀的控溫曲線。可以看出,在設定溫度為50℃時,系統(tǒng)的最大絕對誤差為0.3℃;在70℃時,最大絕對誤差為0.4℃;在90℃時,最大絕對誤差為0.5℃。儀器的控溫精度可達±0.5℃。?
??? 儀器的各項性能指標如下:?
??? (1)加熱溫度范圍:50℃～100℃;?
??? (2)加熱控溫精度:±0.5℃;?
??? (3)處理樣品容量:50μl～150μl;?
??? (4)加熱模塊均勻度:±2℃;?
??? (5)移液精度:±5μl;?
??? (6)移液準確度:±5μl;?
??? (7)移液均勻度:±5μl。?
HS9600全自動核酸提取儀采用模塊化組合設計的思想,由上下位機依據(jù)自己的特點,分別承擔不同的任務,大大提高了儀器的自動化程度,替代了傳統(tǒng)的手工操作,實現(xiàn)批量化提純,可以一次處理96個樣品。?
??? 與傳統(tǒng)的手工操作過程相比,該儀器不僅節(jié)約了大量時間,而且避免了樣本交叉污染,滿足高通量實驗的要求。自動化操作更保證了實驗結果的穩(wěn)定可靠,滿足了便捷、高效、準確的核酸檢測要求。該儀器與達安核酸提取吸附劑配套使用,打破磁珠試劑在核酸提取技術上形成的技術和市場壟斷,為廣大客戶提供了更為全面和完善的實驗解決方案。?
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